Hoàn thiện phương pháp và nghiên cứu sự đa dạng di truyền trên quần thể mắm biển ở khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn cần giờ bằng kỹ thuật rapd

MỤC LỤC Chương Trang Trang tựa ii Lời cảm ơn .iii Tóm tắt .iv Mục lục .v Danh sách các chữ viết tắt viii Danh sách các hình .ix Dang sách các bảng x Chương 1 LỜI MỞ ĐẦU . 1 1.1 Đặt vấn đề . 1 1.2 Mục đích, yêu cầu .2 1.2.1 Mục đích .2 1.2.2 Yêu cầu .2 1.2.3 Hạn chế của đề tài .2 Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 2.1 Một số khái niệm về đa dạng sinh học 3 2.1.1 Đa dạng sinh học .3 2.1.2 Đa dạng di truyền 3 2.1.3 Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền 4 2.2 Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .4 2.2.1 Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ .4 2.2.2 Cấu trúc của khu dự trữ rừng ngập măn Cần Giờ .8 2.2.3 Công tác quản lý khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 9 2.3 Cây mắm biển 11 vi 2.3.1 Hình thái học . 11 2.3.2 Nơi sống và sinh thái . 12 2.3.3 Phân bố 12 2.3.2. Quy trình ly trích DNA thực vật . 13 2.4.1 Định lượng DNA bằng phương pháp quang phổ 14 2.4.2 Định tính DNA ly trích bằng phương pháp điện di 15 2.5 Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền 16 2.5.1 Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử 16 2.5.1.1 Chỉ thị hình thái . 17 2.5.1.2. Chỉ thị isozyme . 17 2.5.1.3 Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA . 18 2.5.2 Kỹ thuật PCR 18 2.5.2.1 Nguyên lý kỹ thuật PCR . 18 2.5.2.2 Quy trình chuẩn của phản ứng PCR 19 2.5.2.3 Tối ưu hoá phản ứng PCR .21 2.5.3 Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) .22 2.5.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) .22 2.5.4.1 ưu điểm của kỹ thuật RAPD 25 2.5.4.2 Nhược điểm của kỹ thuật RAPD 25 2.5.4.3 Ứng dụng của kỹ thuật RAPD 25 Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHưƠNG PHÁP TIẾN HÀNH .27 3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện .27 3.1.1 Thời gian nghiên cứu 27 3.1.2 Địa điểm thực hiện 27 3.2 Vật liệu thí nghiệm 27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 vii 3.3.1 Vật liệu dùng trong ly trích DNA .27 3.3.2 Quy trình ly trích DNA .31 3.3.3 Kiểm tra kết quả ly trích DNA 33 3.3.4 Thực hiện kỹ thuật RAPD .34 3.3.4.1 Dụng cụ và hóa chất dung trong kỹ thuật RAPD 34 3.3.4.2 Bố trí thí nghiệm .35 3.4 Phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS .38 Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .40 4.1 Kết quả thu thập mẫu mắm tại rừng ngập mặn Cần Giờ 40 4.2 Bảo quản mẫu và hoàn thiện quy trình ly trích DNA .41 4.2.1 Bảo quản mẫu 41 4.2.2 Hoàn thiện quy trình ly trích .41 4.3 Kết quả chạy RAPD 43 4.3.1 Thí nghiệm 1: Sử dụng primer RAH8 với chu kỳ nhiệt 1 43 4.3.2 Thí nghiệm 2: Sử dụng primer 1 với chu kỳ ở Bảng 44 4.3.3 Thí nghiiệm 3 45 Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 48 5.1.1 Kết luận .48 5.1.2 Đề nghị 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO .50 PHỤ LỤC 52 ix DANH SÁCH CÁC HÌNH HÌNH TRANG Hình 2.1: Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ 5 Hình 2.2: Cấu trúc cành, lá và trái Mắm 11 Hình 2.3: Nguyên lý của phản ứng PCR 21 Hình 2.4: Nguyên lý phân tích chỉ thị RAPD trong nghiên cứu sự đa dạng di truyền 25 Hình 4.1: Trái mắm biển(A); Hoa(B) .41 Hình 4.2: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Cần Giờ 42 Hình 4.3: Kết quả ly trích theo quy trình 1 44 Hình 4.4: Sản phẩm DNA ly trích theo quy trình cải tiến (quy trình 2) 44 Hình 4.5: Kết quả PCR ở thí nghiệm 1 45 Hình 4.6: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 2 .46 Hình 4.7: Sản phẩm PCR ở thí nghiệm 3 .47 Hình 4.8 : Cây phân nhóm một số cây mắm biển tại khu dự trữ sinh quyển rừng Cần Giờ 48 x DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel agarose có nồng độ khác nhau 16 Bảng 2.2: Sự phân tách các đoạn DNA trong gel polyacrylamide có nồng độ khác nhau 16 Bảng 3.1: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm 1 36 Bảng 3.2: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 1 36 Bảng 3.3: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm2 .37 Bảng 3.4: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 2 37 Bảng 3.5: Thành phần hóa chất sử dụng trong phản ứng RAPD ở thí nghiệm3 38 Bảng 3.6: Chu kỳ nhiệt cho phản ứng RAPD của thí nghiệm 3 38